维生素D受体抑制EMT发生对宫颈癌化疗药物敏感性的影响研究

一、 介绍国内外的研究现状，结合自己硕士期间的研究基础，发现了什么科学问题及应用前景，引出自己的研究计划。

1.1研究现状

宫颈癌是临床最为常见的一类妇科恶性肿瘤。尽管当前对于宫颈癌早期筛查推广、宫颈癌手术及放化疗等综合应用有效的提高了此类患者的生存率，但宫颈癌肿瘤转移仍是当前影响患者预后的一个重要因素。临床发现，在宫颈癌肿瘤转移过程当中，其上皮细胞显示出间质细胞特性，即上皮细胞发生上皮间质转化（epithelial -mesenchymal transition，EMT），从而导致脱离原发灶并促使形成局部、远处转移^[1-2]。同时，临床针对维生素 D对肿瘤抵抗作用的研究发现，1,25(OH)₂D₃ 抑制肿瘤细胞增殖、迁移、端粒酶活性、血管生成和EMT过程。而维生素D 所发挥的作用则是通过活性维生素D（1,25(OH)₂D₃）与维生素D受体（VDR）相结合后发挥的^[3]。因此，临床研究认为，维生素D受体可抑制EMT发生进而影响肿瘤转移过程^[4-6]。此外，目前研究报道显示，宫颈癌患者血清中维生素D的水平显著降低，但在宫颈癌组织当中VDR表达呈升高的趋势，提示维生素D及VDR可能参与宫颈癌发生、发展的复杂分子机制^[7]。结合相关研究发现，在宫颈癌患者体内维生素D受体可抑制EMT发生，其或影响宫颈癌化疗过程及效果，故研究以探讨维生素D受体抑制EMT发生对宫颈癌化疗药物敏感性的影响。

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二、 阐述计划的研究内容。

通过免疫组化分析宫颈癌病人癌组织与正常宫颈组织中VDR的表达，从而探讨VDR表达水平与宫颈癌肿瘤浸润转移程度的关系。同时，通过体外实验分析维生素 D受体对EMT抑制作用及对宫颈癌细胞增殖能力、迁移能力与维生素D受体抑制EMT发生对宫颈癌化疗药物敏感性的影响。

2.1主要材料

鼠源性宫颈癌细胞株 U14；
       
人宫颈癌细胞株SiHa细胞；

单载体可诱导RNAi系统（pSingle-tTS-shRNA载体质粒，pSingle-tTS-Anti-Lue对照质粒）；

人宫颈癌组织芯片。

2.2主要仪器.

       普通PCR仪及梯度PCR仪；三用恒温水箱；荧光倒置显微镜；磁力搅拌器；实时定量PCR仪；台式高速离心机；机械型微波炉；单人单面净化台；琼脂糖电泳系统；低温冰箱；凝胶成像系统；电子天平；高温灭菌锅；CO₂恒温培养箱；台式高速低温离心机；纯水仪；PAGE胶电泳系统。

2.3主要试剂
 
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3、试验内容

3.1免疫组织化学染色

     （1）烤片；（2）脱蜡；（3）组织抗原修复；（4）消除组织内源性过氧化物酶；（5）封闭；（6）孵育一抗；（7）孵育二抗；（8）孵育三抗；（9）DAB显色；（10）染细胞核；（11）脱水封片

3.2细胞免疫荧光
   
 （1）铺板；（2）洗涤；（3）固定与穿透；（4）洗涤；（5）抗原封闭；（6）洗涤；（7）孵育一抗；（8）洗涤；（9）孵育二抗；（10）洗涤；（11）细胞核染色；（12）洗涤；（13）封片：荧光封片剂封片；（14）观察：倒置荧光显微镜下观察。

3.3蛋白免疫印迹(Western blot)
     
（1）SDS.PAGE loading buffer裂解抽提蛋白质法；（2）ⅪPA裂解抽提蛋白质法；（3）蛋白定量(BCA定量)；（4）蛋白变性；（5）SDS.PAGE胶的配制；（6）蛋白质转移；（7）抗体孵育；（8）化学发光检测。

3.4细胞培养
       
人宫颈癌细胞株SiHa细胞和鼠源性宫颈癌细胞株 U14置于37℃，5%二氧化碳培养箱中培养。

3.5 CCK-8法检测不同处理SiHa对抗癌药顺铂化疗敏感性
     
（1）制备细胞
  
 取对数生长期的 SiHa P90对照组与VDR处理组细胞，消化后计数，取2*103 细胞接种于 96 孔板的一个孔，一个样品接种需要种 36 个孔（6 个重复），种3 个板。
     
（2）实验条件
   
置 37℃，5%CO₂ 培养箱培养过夜，待细胞贴壁后弃去培养基，用 PBS 洗 3 遍，然后加入含不同浓度 Taxol 的培养基 200ul，同时对照组加入同体积的含有无水乙醇的 10%胎牛血清 DMEM/F12 培养基；实验组培养基中加入不同浓度 Taxol（10，50，100 nM）。每组设六个复孔。将细胞置培养箱培养 48h 后吸掉培养基。然后加 100ul新鲜培养基和 10ul  CCK-8 检测液，37℃孵育 1h，酶标仪检测 450nm 处各孔处吸光度值（A），从而来说明对照组与处理组的 SiHa 对抗癌药物的敏感性差异。

3.6 RNA的提取、反转录及PCR

3.6.1 RNA的提取
     
（1）裂解细胞；（2）抽提核酸；（3）沉淀核酸；（4）75%乙醇洗涤RNA沉淀；（5）加入20ul无RNA酶和DNA酶的水溶解RNA；（6）RNA浓度检测。

3.6.2  mRNA反转录为cDNA

3.6.3 聚合酶链式反应(PCR)3.6.4实时定量PCR(real.time PCR)3.7构建pSingle-tTS-VDR-shRNA载体质粒与SiHa稳定细胞系

3.7.1 VDR shRNA序列的选择

3.7.2 VDR shRNA寡聚核苷酸的设计

3.7.3构建pSingle.tTS.VDR.shRNA质粒

3.7.4绘制目的细胞的杀伤曲线

3.7.5目的质粒的转染

3.7.6转入目的质粒细胞的筛选

3.7.7 VDR蛋白沉默效率的检测

3.8细胞刺激实验
       
细胞刺激48h后，根据后续实验需要选择收取细胞蛋白、RNA、细胞固定进行免疫荧光染色、或者进行transwell和划痕试验。

3.9划痕实验
       
准备实验细胞，根据实验需要对细胞进行预处理，处理完后待细胞状态良好时，准备消化细胞铺板进行划痕实验。划线时间点为0点，分别在0、12、24、36和48h五个时间点对划线部分进行图像采集。

3.10侵袭小室实验(transwell)

3.11 统计学分析
 
三、 拟采取的研究方案（建议附上技术路线），需要采用那些实验手段，分析实验的可行性。
       
研究拟探讨：
     
（1）人宫颈癌组织样本和正常宫颈组织样本中VDR的表达；
     
（2）VDR的表达与宫颈癌临床分期、病理分级相关性；
     
（3）宫颈癌中肿瘤相关巨噬细胞的浸润程度与VDR表达相关性。基于目前很多文献报道，肿瘤相关巨噬细胞在肿瘤的浸润转移过程中起着非常重要的作用，研究将利用免疫组织荧光染色对同一宫颈癌组织标本进行VDR和肿瘤相关巨噬细胞标志蛋白CD163进行共染色，明确肿瘤相关巨噬细胞的浸润程度与VDR表达的关系；
     
（4）进一步探讨前炎症因子、细胞因子对宫颈癌细胞系中VDR表达的调节作用；由于维生素D是VDR的配体，维生素D对VDR有一定的保护作用，为了解在宫颈癌中维生素D对VDR的保护作用，在上述实验基础上，通过TNF-α处理SiHa细胞的同时，在细胞培养基中加入了不同浓度的维生素D，收取细胞蛋白并通过western blot检查其VDR的表达水平，明确维生素D对受体VDR的保护作用。   （5）基于上述实验，进一步探讨VDR表达是否下调介导TNF-α协同TGF-131诱导EMT，分析维生素D受体抑制EMT发生对宫颈癌化疗药物敏感性的影响，在研究中通过CCK-8法检测不同处理的SiHa对抗癌药顺铂化疗敏感性。

四、 研究计划的创新之处
     
 近年来研究发现，较低的1,25-（OH）₂D₃水平和钙摄取量是引发多种癌症的重要影响因素，当前已有不少研究研究证实1,25-（OH）₂D₃能有效降低多种癌症的死亡率。而1,25-（OH）₂D₃主要通过依赖 VDR 途径调节肿瘤细胞的增殖分化，诱导肿瘤细胞凋亡及EMT等，从而发挥抑制肿瘤细胞生长的作用，因此，1,25-（OH）₂D₃及其受体是作为抗癌新药的重要研究方向。对于宫颈癌患者而言，化疗是作为宫颈癌患者临床常用治疗手段，患者对化疗药物敏感性影响其临床治疗效果，研究创新性的探讨维生素D受体抑制EMT发生对于宫颈癌化疗药物敏感性的影响，可为明确维生素D受体对宫颈癌化疗药物的影响机制提供参考。
 
五、 将研究计划拆分成小目标，分配在博士的3/4年中，写出每个阶段想要达到的预期结果及整个计划最终要解决的科学问题。


参考文献

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[2]Purdie D M, Green A C. Epidemiology of endometrial cancer.[J]. Best Practice & Research Clinical Obstetrics & Gynaecology, 2001, 15(3): 341-354.
[3]Mehta, R.G, et al, Vitamin D and breast cancer: Emerging concepts. Cancer letters,2013. 334(1): p. 95-100.
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